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用于牙周炎源性骨缺損修復的3D打印生物墨水

更新時間:2024-02-18點擊次數:962

牙周病是被世界衛生組織認定為危害人類健康的三大疾病之一。恢復牙周炎引起的骨喪失是避免牙齒松動脫落的關鍵步驟之一。然而,由于生物功能材料的應用單一以及口腔炎癥和細菌微環境的存在,目前臨床上廣泛應用的牙周骨再生材料或技術難以實現牙槽骨再生。南方醫科大學口腔醫院于光濤等人聯合深圳灣實驗室饒浪教授課題組設計開發了一種3D打印生物墨水用于牙周炎源性骨缺損修復,該生物墨水由EPLGMA為主體并裝載干細胞和細胞囊泡用于發揮抗菌抗炎促成骨功能。相關研究成果以題為“3D-printed bioink loading with stem cells and cellular vesicles for periodontitis-derived bone defect repair"的文章發表在《Biofabrication》上。南方醫科大學口腔醫院博士研究生趙瑜越、深圳灣實驗室博士后朱文祥為第一作者,南方醫科大學口腔醫院于光濤、容明燈、麻丹丹和深圳灣實驗室饒浪教授為共同通訊作者。



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圖1. 仿生3D打印墨水的制備工藝及其對牙周炎源性骨缺損的生物學作用示意圖



作者首先通過摩方精密microArch® S230(精度:2 μm)打印了以EPLGMA為主體的仿生模板,結合模板法和光引發聚合合成了EPLGMA@PDLSCs@MDCSs-MV(EPM)。具體步驟如下:首先,將GMA緩慢滴入EPL溶液中,得到EPLGMA,在藍光(405 nm)照射后轉化為交聯水凝膠。然后,將乳牙牙周膜的PDLSCs和MDSCs膜囊泡(MDSCs- MV)加入EPLGMA中形成溶液生物墨水。通過掃描電鏡觀察凍干生物墨水的微觀結構,我們可以清楚地看到網狀多孔結構,這有利于促進PDLSCs的增殖、遷移和營養物質或代謝物的運輸,從而發揮作用(圖2)。

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圖2. EPLGMA的特點。(a) EPLGMA制備工藝示意圖。(b) EPLGMA狀態:藍光照射前(左)和照射后(右)。(c)凍干EPLGMA的掃描電鏡。(d) EPL和EPLGMA的1H NMR譜。(e) EPLGMA的時間掃描流變分析。(f) EPLGMA的粘度。(g) EPLGMA的壓應力-應變曲線。



隨后,作者探究了仿生墨水的3D打印性能。作者利用Solidworks軟件建立三維CAD模型,通過對于不同結構的模型進行打印,證明仿生墨水打印出的結構在大尺寸上仍能夠保持一定的精準度。隨后作者用激光共聚焦顯微鏡對打印形狀內的細胞進行顯色觀察,結果顯示細胞在3D打印仿生墨水中的形態下分布均勻,并且保持良好的活力(圖3)。表明了EPM是一種高效、可行、個性化的打印生物墨水。

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圖3. 3D打印系統對EPLMA生物墨水進行個性化3D打印。



為了驗證EPL天然的抗菌潛力,作者將生物墨水與牙齦卟啉單胞菌共培養兩個小時,并將其涂布到血平板上進行觀察。24小時后可見EPM組表現出良好的抗菌效果(圖4)。

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圖4. EPM的抗菌性能。(a) EPM抗菌功能示意圖。(b) PBS(對照)和EPM處理2 h后的牙齦卟啉單胞菌(P.g)的血平板培養照片。(c)不同組牙齦卟啉單胞菌數量的定量評價。(d) PBS(對照)和EPM處理后的牙齦卟啉單胞菌活/死染色。



控制炎癥是牙周炎治療過程中重要步驟。作者利用MDSCs在抗炎中發揮的作用,首先從荷瘤小鼠體內收集MDSCs,并提取MDSCs-MV,然后采用蛋白圖譜分析了MDSCs-MV的蛋白組成。通過KEGG通路分析,結合免疫熒光實驗結果,作者表明MDSCs-MV可以通過CD39/CD73-腺苷信號通路靶向抑制微環境中的T細胞從而發揮抗炎功能(圖5)。

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圖5. MDSCs-MV的抗炎特性(a) MDSCs-MV生物學功能示意圖。(b) Western blot檢測MDSCs和MDSCs- mv的特征性膜蛋白標志物。(c) MDSCs-MV孵育后T細胞的代表性共聚焦圖像。(d) CD3和MDSCs-MV熒光強度線掃描。(e)流式細胞術定量T細胞MDSCs-MV的熒光強度。(f) Elisa法檢測轉染MDSCs-MV或不轉染MDSCs-MV后T細胞分泌腺苷的情況。(g)經MDSCs-MV或不經MDSCs-MV孵育后CD4+ T細胞CFSE稀釋的典型流式細胞術圖。(h)不同組CD4+ T細胞CFSE稀釋度的定量分析。(i) CD8+ T細胞加或不加MDSCs-MV孵育后CFSE稀釋后的典型流式細胞術圖。(j)不同組CD8+ T細胞CFSE稀釋度的定量分析。



最后,為了評估3D生物墨水的成骨能力,作者構建了SD大鼠頜骨骨缺損模型,并同期模擬炎癥狀態,然后根據骨缺損的面積以及深度,打印出合適的形狀并進行了驗證。經過3個月的治療后,通過Mirco-CT以及免疫熒光實驗結果,EPM@Pg組展示出了最佳的抗菌、抗炎以及促成骨效果(圖6)。

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圖6. EPM的體內骨再生效果。(a)生物墨水治療人工牙周炎骨缺損小鼠模型的實驗設計。(b)用不同生物墨水完成的3d打印。(c)生物墨水治療牙周炎骨缺損的手術過程圖片。(d)術后2、3個月不同治療組下頜骨缺損區具有代表性的三維Micro-CT圖像。(e) - (i) BV (f)、BV/TV (f)、Tb.N (g)和Tb.Th(h)的定量分析。



結論:作者利用EPLGMA加載PDLSCs和MDSCs-MV,制作了一種新型的、可定制的多功能3D打印模塊,用于治療牙周炎源性骨缺損。該EPM材料繼承了EPL的天然抗菌特性,可以有效地殺滅牙周病細菌,并且在抗炎方面,其中的MDSCs-MV通過CD73/CD39/腺苷信號通路抑制T細胞。總之,EPM支架表現出良好的抗菌、抗炎和骨再生效果。與傳統骨粉填充材料相比,3D打印仿生墨水材料具有更加優異的生物性能



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